西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组来源的丙氨酸消旋酶的异源表达及性质研究
丙氨酸消旋酶是异构酶家族中一类重要的酶,既能作为新型抗菌药物筛选的靶标,又是酶法合成D-氨基酸的关键酶之一,有巨大的研究价值.[目的]为挖掘动物胃肠道中未培养微生物的丙氨酸消旋酶基因资源,探究不同微生物来源丙氨酸消旋酶基因及其酶的功能和性质.[方法]本研究从西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组出发,基于序列分析和基因功能注释,克隆丙氨酸消旋酶基因并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功异源表达,进行酶功能鉴定和性质研究.[结果]从宏基因组中获得2个丙氨酸消旋酶基因NCalr 1和NCalr 6并进行了重组表达,2基因全长均为1 170 bp,编码389个氨基酸;理论分子量分别为43.58 kDa和43.94 kDa.重组酶的最适pH均为12.0,最适温度为40℃和37℃.在pH 9.0-12.0条件下处理1 h,重组酶相对酶活性仍在90％以上,表明重组酶具有较好的耐碱性;在30-45℃处理1 h,相对酶活仍在85％以上,说明重组酶在30-45℃条件下稳定性好.重组酶的最适PLP浓度为10 μmol/L,添加10μmol/LPLP时,可使得重组酶的相对活性提高30％和7％左右;但当PLP的结合位点由赖氨酸突变为丙氨酸后,相对酶活仅为初始酶活的 1％和27％.两重组酶的Km分别为(14.81±1.66)mmol/L 和(25.87±1.95)mmol/L.10 mmol/L 的 Hg2+、Ag+、Zn2+和SDS对重组酶具有强烈的抑制作用;Fe3+对重组酶有极强的激活作用,10 mmol/L的Fe3+可将酶活性提高2.6-5.1倍.[结论]本研究首次利用宏基因组学技术从西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组中获得2个新型丙氨酸消旋酶,具有较好的应用前景.
丙氨酸消旋酶、粪便微生物宏基因组、异源表达、酶学性质
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Q939.9;Q78;R978
国家自然科学基金31860299
2022-05-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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1362-1378
