基因编辑技术对大肠杆菌yjjW基因点突变的两步法策略
[目的]为了实现对大肠杆菌靶基因的点突变,本研究将同源重组系统与CRISPR-Cas9技术相结合,探索一种高效、简捷的两步法策略.[方法]将靶基因的上下游同源臂和标记基因(amp)与pKOV质粒连接,获得pKOV-HR重组质粒.将pKOV-HR转化至大肠杆菌,借助其自身RecA重组系统,介导DNA发生同源重组,获得靶基因敲除菌株.随后,靶基因的点突变采用pSGKP-km和pCasKP-apr双质粒系统.首先,设计与amp结合具有定向引导作用的spacer序列,并利用overlap PCR获得带有靶基因点突变的同源臂,将spacer和同源臂与pSGKP-km质粒连接,获得重组质粒pSGKP-km-spacer-HR;接着,将pSGKP-km-spacer-HR和pCasKP-apr质粒转化至上述敲除菌株;最后,利用质粒表达的Cas9切割蛋白和λ-Red重组蛋白,发生DNA同源重组,获得靶基因点突变菌株.[结果]利用上述方法,既成功获得了大肠杆菌yjjW敲除菌株D7△yjjW::ampR,又实现了yjjW第24位碱基T到C的点突变,获得点突变菌株D7yjjW-24.[结论]本研究建立了一种高效、简捷的大肠杆菌靶基因点突变方法,amp基因的插入提供了有效的筛选标记,此外该方法建立的重组质粒pSGKP-km-spacer,可应用于同种菌株其他靶基因的点突变,能够缩短后续实验操作,为基因编辑技术的发展提供了科学理论以及实验操作基础.
CRISPR-Cas9、大肠杆菌、同源重组、点突变
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国家自然科学基金;中国科学院科技服务网络计划;北京林业大学大学生创新计划
2021-03-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共12页
183-194
