Pseudomonas putida KT2440低特异性L-苏氨酸醛缩酶的表达、酶学性质及温度稳定性提高
[目的]从Pseudomonas putida KT2440基因组中,钓取低特异性L-苏氨酸醛缩酶基因(ltaE),构建重组大肠杆菌.研究目标酶的酶学性质,和关键氨基酸位点突变对酶活和温度稳定性的影响.[方法]以P.putida KT2440基因组DNA为模板,PCR扩增出ltaE基因,构建重组表达质粒pET28a-KT2440并转化Escherichia coli BL21 (DE3),获得重组菌E coli BL21 (DE3)/pET-KT2440,利用Ni2+柱亲和层析纯化低特异性L-苏氨酸醛缩酶(LTA),对关键氨基酸位点Thr206和Lys207实施定点突变.[结果]SDS-PAGE结果表明LTA在大肠杆菌中获得高效表达,分子量为40 kDa左右,与理论值大小相符.Ni2+柱亲和层析纯化LTA,获得单一条带.利用双酶耦联法测得LTA酶活为5577.3 U/mg,最适反应温度为50℃,最适pH为8.0.在温度低于45℃,pH 5.0-9.0时,重组酶较稳定.LTA酶的Km和kcat值为23.95 mmol/L和19216.6 s-1.Mg2+、Ca2+金属离子对LTA有明显的促进作用,而Ni2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+等对酶有明显的抑制作用.该酶在叔丁基甲基醚溶剂中具有良好的耐受性,在叔丁基甲基醚中保存1h后仍保留90％以上的酶活.Thr206Ser突变明显提高了酶对温度的稳定性.Lys207对酶催化功能是必需的,该位点突变对酶活都是致死的.[结论]克隆并表达P.putida KT2440的LTA酶,研究了酶学性质,通过定点改造提高了酶的温度稳定性,筛选获得一种酶耐受性好的有机溶剂,为LTA酶在有机溶剂中高效稳定催化β-羟基-α-氨基酸奠定了较坚实的研究基础.
恶臭假单胞菌、低特异性L-苏氨酸醛缩酶、酶学性质、致死突变、温度稳定性
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国家自然科学基金31370100;江苏省六大人才高峰高层次人才资助项目2015-SWYY-010;高等学校学科创新引智计划资助111-2-06
2019-11-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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2013-2023
