嗜虫耶尔森氏菌HlyA及HasA外分泌表达系统的构建
[目的]构建一株具备外分泌蛋白功能的工程菌,解决杀虫毒素无法由胞内分泌至胞外,无法直接作用于虫体等问题,为松墨天牛防治提供新思路.[方法]本研究先测定从松墨天牛肠道及其生境中分离出的嗜虫耶尔森氏菌(CSLH88)的生长特性及抗性,进而对其进行分子改造.构建HlyA (pGHKW2)以及HasA (pGHKW4)外分泌表达载体,利用电穿孔法将其转人CSLH88菌株,获得能够表达绿色荧光蛋白的工程菌.利用稀释涂板及荧光体式镜检测技术对两个质粒进行遗传稳定性检测,并采用SDS-PAGE及Westem blotting技术验证蛋白外分泌功能.[结果]CSLH88菌株培养2-4 h能够进入对数生长期,并对卡那霉素(Kan)敏感.成功构建了含有Kan抗性基因的pGHKW2 (GenBank:MK562405)和pGHKW4 (GenBank:MK562404)两个外分泌表达载体的CSLH88工程菌株.其中,发现pGHKW4质粒更加适合在嗜虫耶尔森氏菌中稳定遗传.SDS-PAGE及Western blotting检测结果表明HlyA系统无法在CSLH88菌株中将目的蛋白分泌到胞外,而HasA系统则可以有效地发挥外分泌表达功能.[结论]通过对HlyA及HasA两个外分泌表达系统进行研究,从中筛选出HasA型血红素转运系统作为CSLH88菌株的外分泌表达系统,为后续外分泌杀虫毒素蛋白菌株构建以及CSLH88菌株的致病性研究奠定基础.
松墨天牛、嗜虫耶尔森氏菌、外分泌表达系统、绿色荧光蛋白
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国家重点研发计划课题2017YFD0600105;国家自然科学基金31601905;福建省科技厅自然科学基金2016J01097;福建省科技计划项目2018N5002;福建农林大学科研基金xjq201614;福建农林大学林学院林学高峰学科项目71201800720,71201800753,71201800779;福建省大学生创新创业训练计划项目201810389102;福建省林业科学研究项目Minlinke 2017 03
2019-09-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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