多形拟杆菌肝素酶Ⅰ的SUMO融合表达及酶学特性分析
[目的]克隆多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron) Heparinase Ⅰ基因,在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行基因工程表达获得重组酶SUMO-Bt-HepI和Bt-HepI,并研究其酶学特性.[方法]对B.thetaiotaomicron肝素酶Ⅰ(Bt-HepⅠ)的基因序列进行密码子优化,PCR扩增得到目的基因,构建表达载体pET-28a-Bt-HepⅠ和pE-SUMO-Bt-HepⅠ,并转化至E.coli Rosetta (DE3)进行表达,分别得到重组产物Bt-HepⅠ和SUMO-Bt-HepⅠ,以肝素钠为底物研究两者的酶学性质.[结果]SDS-PAGE检测显示Bt-HepⅠ和SUMO-Bt-HepⅠ的分子量大小分别约为42.5 kDa和55 kDa.与Bt-HepⅠ相比,融合SUMO-Tag后的肝素酶Ⅰ比酶活提高了48.9％.酶学性质表明:Bt-HepⅠ和SUMO-Bt-HepⅠ的最适pH和温度均为pH 9、45℃C,二者在pH 5-9都具有很好的稳定性,但pH＜5时,SUMO-Bt-HepⅠ的耐酸性明显高于Bt-HepⅠ.同时,在温度低于50℃时,SUMO-Bt-HepⅠ的比酶活高于Bt-HepⅠ.此外,Ca2+和Mg2+对重组肝素酶Ⅰ具有明显的促进作用,而Cu2+、Mn2+、Zn2+则表现出一定的抑制作用,提示在多形拟杆菌肝素酶Ⅰ的结构中除了存在已知的Ca2+结合位点外,可能还存在Mg2+的结合位点.[结论]本研究首次将多形拟杆菌来源的肝素酶Ⅰ和SUMO-Tag进行了融合表达,使其比酶活得到了显著的提高,为其生产应用奠定了基础.
多形拟杆菌、肝素酶Ⅰ、SUMO-Tag、融合表达、酶学性质
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国家重点研发计划2017YFD0400303;国家“863计划”2012AA021505
2019-07-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共13页
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