Candida amazonensis FLP/FRT基因敲除系统的构建及初步验证
[目的]构建一个适用于Candida amazonensis抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因敲除系统,并通过敲除C.amazonensis的丙酮酸脱羧酶基因(Pyruvate decarboxylase,PDC)对该系统进行初步验证.[方法]以gfpm(绿色荧光蛋白基因)为报告基因,通过添加相应诱导剂评估Spathaspora passalidarum来源启动子(SpXYLp、SpMAL6p、SpMAL1p、SpGAL1p)和Saccharomyces cerevisiae来源ScGAL1p启动子在C.amazonensis中的诱导调控性能.选择严格诱导型启动子调控FLP重组酶的表达,并在FLP表达盒和潮霉素(Hygromycin B)抗性标记基因(hphm)两端添加同向重复的FRT位点,以PDC基因作为靶基因构建敲除盒PRFgHRP,转化宿主菌C.amazonensis CBS 12363,筛选得到阳性转化子后,通过添加诱导剂,表达FLP重组酶,实现FRT位点间片段切除.[结果]诱导调控实验表明启动子SpGAL1p(受半乳糖诱导)和SpMAL1p(受麦芽糖诱导)是适用于C.amazonensis的严格诱导型启动子.以SpGAL1p调控FLP基因表达,构建的敲除盒PRFgHRP成功转化宿主菌,获得阳性转化子C.amazonensis PDCO1,通过添加半乳糖诱导,成功切除基因组中FLP表达盒和抗性标记盒,获得突变株C.amazonensis PDC02.[结论]首次建立了一个适用于C.amazonensis抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因敲除系统,并利用该系统成功敲除了C.amazonensis内的PDC基因,为进一步利用代谢工程改造C.amazonensis酵母奠定了良好基础.
Candida amazonensis、FLP/FRT、诱导型启动子、基因敲除
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X1 ;TS2
the China Spark Program2015GA690004;by the Jiangsu Science Fund for Distinguished Young Scholars BK20140002国家星火计划重点项目2015GA690004;江苏省杰出青年基金BK20140002
2017-12-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共14页
1839-1852
