不对称水解(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯新菌种的分离鉴定及酯酶基因的克隆、表达
[目的]筛选鉴定1株可以选择性水解农药甲霜灵的中间体(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯(MAP)的菌株,并克隆、表达该菌株中的酯酶基因.[方法]以MAP为唯一碳源,对活性污泥样品中的微生物进行富集培养,采用罗丹明B平板显色法进行初筛,通过摇瓶复筛得到了1株对MAP具有最高对映体选择性和水解活力的新菌株,根据其形态、生理生化特征及16S rRNA序列分析,确立该菌株的系统发育学地位.构建该菌株的基因文库,筛选获得含目的基因的克隆子,通过序列分析和引物扩增得到酯酶基因,将基因与表达载体pET28a(+)连接后,转化大肠杆菌BL21Gold (DE3) plysS,构建重组菌.[结果]该菌属于革兰氏阴性菌,结合16S rRNA基因、形态特征和生理生化实验结果,鉴定该菌为反硝化无色杆菌.通过基因文库法,找到了该菌中的酯酶基因EHest,并成功构建了重组大肠杆菌EHest-pET28a(+)-BL21 Gold (DE3) plysS,表达了来自Achromobacter denitrificans 1104且具有不对称水解MAP活性的酯酶EHesterase,大小约27 kDa,表达酶活是原始菌株的27.1倍.用EHesterase催化MAP水解,底物浓度50 g/L,反应1h,底物转化率为29.5％,产物(酸)的eep为85.1％,对映体选择性为R型.该酶的最适反应pH和温度分别为pH 9.0和50℃.它水解MAP的活性分别是水解橄榄油和乙酸乙酯活性的333倍和667倍.[结论]筛选到1株具有不对称水解MAP能力的新菌株Achromobacter denitrificans 1104.
反硝化无色杆菌、(R、S)-2、6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯、对映体选择性水解、酯酶基因、克隆表达、甲霜灵
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国家自然科学基金21447005;Supported by the National Natural Science Foundation of China 21447005
2016-09-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
1335-1347
