定点突变对酰胺水解酶DamH可溶性表达和酶活的影响
[目的]DamH是一种具有酯酶活性的酰胺水解酶,其非活性中心氨基酸残基的突变对重组酶可溶性表达和比酶活产生一定的影响.拟探索DamH的活性中心氨基酸残基构成,并对其非活性中心氨基酸残基突变对可溶性表达和比酶活的影响进行研究.[方法]通过重叠延伸的方法对DamH可能的活性中心氨基酸S149、E244和H274以及非活性中心氨基酸D165及N192进行定点突变,通过静息细胞测活验证了S149、E244和H274在催化2-氯-N-(2’-甲基-6’-乙基苯基)乙酰胺(CMEPA)水解反应中的作用,通过Ni2+-NTA亲和层析对D165及N192突变子进行纯化,对突变株和野生型比酶活进行比较.[结果]研究表明S149A使DamH的CMEPA水解酶活性下降为野生型的5％,E244A和H274A突变导致其失去活性;D165P和N192P突变影响到DamH的可溶性表达,表达量分别为野生型的28.2％和20.8％,突变子N192P、D165P比酶活分别为野生型比酶活的55.5％和49.7％.[结论]DamH催化酯类底物和芳基酰胺类底物可能共用同一活性中心S149、E244和H274,其两个α螺旋的转角处氨基酸侧链极性和刚性结构的改变对可溶性表达以及活性有很大的影响.
DamH、定点突变、催化三联体、可溶性表达、比酶活
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Q814(生物工程学(生物技术))
国家自然科学基金地区科学项目31560031;国家自然科学基金面上项目31570059Supported by the Natural Science Foundation of China 31560031,31570059
2016-01-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
1584-1592
