乙酸钙不动杆菌磷脂酶C在大肠杆菌中重组表达、纯化及酶学性质分析

摘要：

[目的]构建乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus) ATCC17902磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)的重组大肠杆菌菌株、纯化重组酶并进行酶学性质分析比较.[方法]以A.calcoaceticus ATCC17902基因组DNA为模板,PCR扩增得到两段磷脂酶C基因(PLC1、PLC2),构建重组大肠杆菌表达质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)中,实现PLC1、PLC2基因的表达.IPTG诱导表达后,经镍柱亲和层析纯化重组蛋白.[结果]成功构建两株产磷脂酶C的重组大肠杆菌并纯化,样品经SDS-PAGE分析在80 kDa附近均出现显著的特异性条带.NPPC法测得PLC1、PLC2酶活分别为31160 ±418 U/mg、13640±354 U/mg,最适反应温度分别为65、50℃,最适pH值分别为8、7.5.在低于30℃时,pH值7-8时,PLC1、PLC2重组酶较稳定,40℃处理30min,PLC1酶活稳定而PLC2残余酶活低于25％.Mg2+、Ca2增强PLC1、PLC2的活性,Zn2+增强PLC1酶活性却抑制PLC2酶活.底物特异性分析表明PLC1、PLC2均水解磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PI),对其他种类磷脂不能水解或水解程度很低.[结论]本文首次实现了A.calcoaceticus ATCC17902来源的磷脂酶C的重组表达与功能验证,为其它食品安全性微生物来源的磷脂酶C的研究提供了一定的借鉴意义.

关键词：乙酸钙不动杆菌、磷脂酶C、纯化、重组表达

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分类号：Q936(微生物学)

资助基金：Supported by the National Programs for High Technology Research and Development of China 2011AA100905,by the Program for New Century Excellent Talents in University NCET-11-0665 and by the Research Program of Sate Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University SKLF-ZZA-201201;国家“863计划”2011AA100905;教育部“新世纪优秀人才支持计划”NCET-11-0665;江南大学食品科学与技术国家重点实验室自由探索资助课题SKLF-ZZA-201201

在线出版日期：2014-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：1221-1227