原玻璃蝇节杆菌D-氨基酸氧化酶及突变体的酶学特性

摘要：

[目的]研究原玻璃蝇节杆菌(DSM 20168)中D-氨基酸氧化酶的酶学特性.[方法]通过PCR从原玻璃蝇节杆菌(DSM 15035,20168)中克隆获得D-氨基酸氧化酶基因apdaao-1和apdaao-2,构建原核表达载体,以表达质粒pET-ApDAAO-2为模板,采用QuickChange Site-Directed Mutagenesis技术构建定点突变体,经过原核表达及纯化获得重组型和突变体酶蛋白,分析其酶学特性.[结果]通过原核表达及纯化成功获得了2个重组蛋白和4个突变体酶蛋白,SDS-PAGE检测显示其分子量均约为36 kDa;酶学特性分析表明,ApDAAO-2和突变体蛋白的最适反应温度为30℃;ApDAAO-2和T286A的最适反应pH范围为7.0-11.0,其它突变体为8.0-11.0;ApDAAO-2和突变体都具有较广泛的底物特异性,除T256K的最适底物为D-Phe外,其余均为D-Met;动力学参数测定结果显示,以二级表观常数k.at/Km表示,对于底物D-Met或D-Phe,ApDAAO-2和4个突变体的kcat/Km值均比ApDAAO-1和pKDAAO高数倍以上.[结论]ApDAAO-2及突变体具有比ApDAAO-1和pKDAAO更广泛的底物特异性和较高的催化效率,有一定的商业应用价值.

关键词：原玻璃蝇节杆菌、D-氨基酸氧化酶、定点突变、二级表观常数

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分类号：Q936(微生物学)

资助基金：河北省自然科学基金C2011205045;河北省科技支撑项目10205521D;河北省留学回国人员资助项目20100705;河北省高等学校科学技术研究青年基金项目2011102;河北师范大学重点基金项目L2012Z12,L2009B13;Supported by the Natural Science Foundation of Hebei Province C2011205045,by the Hebei Science and Technology Development Foundation 10205521D,by the Hebei Foundation for Returnees 20100705,by the Youth Foundation of Hebei Educational Committee 2011102 and by the Science Fundation of Hebei Normal University L2012Z12,L2009B13

在线出版日期：2014-09-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：897-904