重构酿酒酵母N-糖基化途径生产人源化糖蛋白

摘要：

[目的]为了在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中生产人源化的糖蛋白,必须对N-糖基化途径进行基因工程改造.作者通过敲除一些酵母N-糖基化途径中的特异性糖基转移酶,得到一株可以用于继续表达人类糖基转移酶的重组菌,并通过生长适应性进化技术回复其细胞生长能力.[方法]首先运用酵母遗传学和分子生物学技术敲除酿酒酵母的α-1,3-甘露糖基转移酶基因(ALG3)、α-1,6-甘露糖基转移酶基因(OCH1)和α-1,3-甘露糖基转移酶基因(MNN1).采用蔗糖酶(invertase)活性染色实验初步检测N-糖链的变化,然后通过高效液相色谱和甘露糖苷酶酶切实验对其糖链结构进行鉴定.重组菌通过在高温条件下进行生长适应性进化,筛选出生长能力回复突变的菌株.[结果与结论]构建了△alg3 △och1△mnn1菌株得到人类糖基化中间体Man5GlcNAc2,并对上述三缺陷型菌株进行适应性进化提高其细胞生长能力和环境适应能力.此外,作者还发现,该重组菌存在少量Man6GlcNAc2结构的糖链.经体外α-1,2-甘露糖苷酶切处理后,糖链Man5GlcNAc2和Man6GlcNAc2均转化为Man3GlcNAc2,表明形成Man3GlcNAc2之后的甘露糖之间均通过α-1,2-糖苷键连接.△alg3 △och1 △mnn1菌株的构建获得了生产人源化糖蛋白的酿酒酵母表达系统,为进一步糖基化改造和工业应用提供了良好的基础.

关键词：人源化、N-糖基化、适应性进化、酿酒酵母

所属期刊栏目：54

分类号：Q935(微生物学)

资助基金：Supported by the Key Grant Project of Chinese Ministry of Education,by the Self-determined Research Program of Jiangnan University JUSRP211A25 and by the Open Project Program of the Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education of China KLIB-KF201106;教育部科学技术研究重大项目;江南大学自主科研计划项目基金JUSRP211A25;工业生物技术教育部重点实验室开放课题KLIB-KF201106

在线出版日期：2015-08-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：509-516