基于筛选标记整合拷贝增加的酿酒酵母外源蛋白高效表达
[目的]利用酿酒酵母内部核糖体进入位点(IRES)介导构建外源蛋白高效表达系统,构建酿酒酵母蛋白表达工程菌,为酿酒酵母在代谢工程中的应用奠定基础.[方法]首先分别构建含启动子Pilv5,Padh2,Ptdh3的Promoter-mCherry-TIF4631 IRES-URA3共表达框,利用同源重组的方法将共表达框整合到酿酒酵母W303-1B-A基因组中,经URA3功能回复筛选转化子.然后比较转化子中mCherry荧光强度的差异,以表征三种启动子在共表达框中的应用效果.利用荧光定量PCR测定并分析转化子中整合DNA片段在基因组中的拷贝数,并在无选择压力的条件下连续传代培养转化子,分析其遗传稳定性.最后以木糖还原酶基因XYL1,β-半乳糖苷酶基因LACZ替换共表达框中的mCherry基因,检测木糖还原酶(xylose reductase)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的酶活力、蛋白表达量等,以验证该表达框的应用效果.[结果]整合DNA片段的拷贝数和mCherry的表达量受启动子影响.其中含Padh2的转化子最低,含Ptdh3的转化子居中,含Pilv5的转化子最高.含有Pilv5启动子且mCherry表达量最高的转化子,整合DNA片段在基因组中的拷贝数为47,构建的工程菌株具有较好的遗传稳定性.在含Pilv5启动子和TIF4631 IRES的表达框中,木糖还原酶成功表达,其中活力最高的转化子WIX-10的酶活力为0.209 U/mg粗蛋白；β-半乳糖苷酶也成功表达,其中酶活力最高的转化子WIL-1的酶活力为12.58 U/mg粗蛋白.[结论]在酿酒酵母中,由Pilv5启动子和TIF4631IRES介导的外源蛋白表达系统能够高效表达外源蛋白,为外源蛋白在酿酒酵母中表达提供了新的策略,也为该系统在酿酒酵母代谢工程中的应用提供了充分的实验依据.
IRES、启动子、酿酒酵母、拷贝数、稳定性
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Q935(微生物学)
国家"973计划"2012CB72110;the Key Project of Chinese National Programs for Fundamental Research and Development2012CB72110
2013-11-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共10页
1195-1204
