构建具有巨细胞病毒(CMV)启动子的杆状病毒高效表达载体并利用其在鸡胚原代细胞中表达eGFP基因
[目的]杆状病毒载体在哺乳动物细胞中不复制,具有极高的生物安全性,而通过引入细胞特异性启动子、“病毒假型化”、添加不同功能调控元件等优化手段,杆状病毒可转导的细胞类型明显增多、转导效率明显增高.优化的重组杆状病毒可以在鸡细胞中表达,确定重组杆状病毒在鸡细胞中高效表达的条件,为禽类基因工程疫苗的开发奠定了坚实的基础.[方法]本研究以增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP)为报告基因,构建含巨细胞病毒(Cytomegaoviyns,CMV)启动子启动的重组转座载体,并且通过病毒假型化(TM/CTD of VSV-GED)、添加转录后调控元件(Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element,WPRE)和腺病毒反向重复序列(Inverted terminal repeats,ITRs)等手段优化重组杆状病毒表达载体,最终利用重组杆状病毒对鸡胚原代细胞的侵染进行eGFP的表达,比较分析不同重组载体对蛋白表达水平的影响.[结果]eGFP表达结果显示,12h便可在倒置荧光显微镜下检测出eGFP的表达,随着时间的延长,eGFP表达效率先增加后降低.经过VSVGED病毒假型化的重组杆状病毒转导效率从36％增加至48.2％.添加转录后调控元件WPRE的重组杆状病毒介导eGFP的表达效果与添加10mmol/L丁酸盐法基本相同,但对细胞几乎没有毒性.从72 h内的eGFP表达强度看,只有添加ITRs元件的重组杆状病毒的表达强度随时间的延长而极缓慢增加.[结论]eGFP表达结果显示,利用VSVGED病毒假型化手段可以提高杆状病毒转导鸡胚原代细胞的效率；添加转录后调控元件WPRE的重组杆状病毒介导eGFP的表达效果与添加丁酸盐法基本相同,可以增强杆状病毒介导报告基因在鸡胚原代细胞中的表达水平；添加ITRs元件的重组杆状病毒具有延长eGFP表达时间的作用.
杆状病毒、鸡胚原代细胞、VSVGED病毒假型化、调控元件、腺病毒反向重复序列
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S852.65(动物医学（兽医学）)
the National Natural Science Foundation of China31270143;by the High-level Talents innovation team Projects of Heilongjiang UniversityHdtd2010-17;by the Education Department of Heilongjiang Province;国家自然科学基金31270143;黑龙江大学高层次人才创新团队支持计划Hdtd2010-17;黑龙江省教育厅科学技术研究项目12511423;黑龙江省高等学校科技创新团队
2013-07-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共10页
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