葡萄糖酸氧化杆菌木糖醇脱氢酶基因的克隆与表达
[目的]获得葡萄糖酸氧化杆菌(Gluconobacter oxydans CGMCC 1.637)的木糖醇脱氢酶基因,研究其酶学性质及碳源特别是D-阿拉伯醇和木糖醇对该酶活性的影响.[方法]通过已报道序列的木糖醇脱氢酶的保守区设计引物,用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增获得目的基因片段.根据获得的片段序列设计引物克隆目的基因的5＇和3＇片段,将所获得的片段拼接,获得完整的木糖醇脱氢酶基因.通过构建工程菌获得重组蛋白,并利用氧化还原反应测定重组酶的活性.用含不同碳源的培养基培养G.oxydans CGMCC 1.637,并测定其破胞上清液木糖醇脱氢酶氧化木糖醇的活性；用不同碳源培养的G.oxydans CGMCC 1.637转化木酮糖,用高效液相色谱法测定木糖醇的产量.[结果]获得一个新的798bp的木糖醇脱氢酶基因,所编码的木糖醇脱氢酶含265个氨基酸,属于短链脱氢酶家族.酶学性质研究发现,该木糖醇脱氢酶催化木糖醇氧化的最适合条件为35℃、pH 10.0,最高活性为23.27 U/mg,催化木酮糖还原为木糖醇的最适条件为30℃、pH 6.0.最高活性为255.55 U/mg;该木糖醇脱氢酶的对木糖醇的Km和Vmax分别为78.97 mmol/L和40.17 U/mg.碳源诱导实验表明,d-山梨醇对G.oxydans CGMCC 1.637木糖醇脱氢酶的活性有明显的促进作用,而葡萄糖、果糖、木糖、木糖醇、D-阿拉伯醇对木糖醇脱氢酶活性有明显的抑制作用.而在转化实验中,用d-甘露糖培养的G.oxydans CGMCC 1.637的转化能力明显高于其他碳源培养的G.oxydans CGMCC 1.637的转化能力,其中,用阿拉伯醇培养的G.oxydans CGMCC 1.637的转化能力最低,仅为对照的35％.[结论]克隆自G.oxydans CGMCC 1.637的木糖醇脱氢酶基因是一个新的基因,用阿拉伯醇培养的G.oxydans CGMCC 1.637破胞液木糖醇脱氢酶活性低；且阿拉伯醇对G.oxydans CGMCC 1.637木酮糖的还原能力具有抑制作用.
葡萄糖酸氧化杆菌(Gluconobacter oxydans)、短链脱氢酶/还原酶家族、木糖醇脱氢酶、D-木酮糖、木糖醇、克隆
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Q814(生物工程学(生物技术))
2012-08-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
726-735
