小环载体介导的siRNA稳定抑制乙肝病毒的复制和表达
[目的]尝试构建表达小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)的小环载体,并初步鉴定其对乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)复制及其基因表达的抑制作用.[方法]设计并合成靶向HBV S区的siRNA,将其克隆到小环载体pMC.BESPX-MCS2上,测序正确后将重组体pMC-H1 -siHBS-U6转化入感受态E.coli ZYCY10P3S2T,然后在培养基中加入L-阿拉伯糖,诱导其降解细菌骨架,获取只含有目的基因表达盒的小环RNA干扰载体pmc-H1 -siHBS-U6.将小环RNA干扰载体与HBV真核表达质粒pHBV1.3共转染Huh-7细胞,分别在转染后1-7天,ELISA法检测Huh-7细胞上清中的HBsAg、HBeAg,并且通过Real-time RT-PCR法分析干扰RNA对HBV DNA及mRNA的抑制效果.[结果]成功构建了靶向HBV S基因的siRNA小环表达载体pmc-H1-siHBS-U6.该载体能显著抑制Huh-7细胞HBsAg和HBeAg分泌,并且其抑制效果能够维持2-3周时间.Real-time PCR证实HBV的DNA与mRNA水平分别降低了71%和80%,而对照siRNA及空载体则无此作用.[结论]成功构建了靶向HBV的小环RNA干扰载体,并且其能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达与复制,该研究不仅对探索HBV的基因治疗提供了重要线索,而且为RNA干扰的应用提供了新的运载体系.
小环载体、乙肝病毒(hepatitis B virus、HBV)、RNA干扰、Huh-7细胞
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Q933(微生物学)
国家自然科学基金81071770
2012-05-17(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)
191-197