假蜜环菌黄曲霉毒素氧化酶的基因克隆、表达、纯化及酶学性质分析
[目的]黄曲霉毒素氧化酶( aflatoxin-oxidase,AFO)来源于假蜜环菌(Armillariella tabescens)的细胞内提取物,具有转化黄曲霉毒素B1( Aflatoxin B1,AFB1)的特性.为更进一步了解该酶的性质,我们克隆了AFO的基因,并进行了重组AFO蛋白的表达、纯化和酶学性质分析.[方法]本研究利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得的AFO短肽序列设计简并引物进行逆转录,再通过cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术获得了AFO基因的全长cDNA序列.构建重组表达载体pPIC9-afo,在毕赤酵母中进行重组AFO( rAFO)的融合分泌表达,用Ni离子螯合层析进行rAFO的纯化,获得有活性的rAFO后,对其进行肽质量指纹(peptide mass fingerprinting,PMF)鉴定和酶学性质分析.[结果]黄曲霉毒素氧化酶( AFO)基因的开放阅读框为2088 bp,编码695个氨基酸；肽质量指纹鉴定结果显示重组AFO的肽片段序列覆盖率为63.2％.活性测定表明纯化后的重组AFO(rAFO)比活力为234 U/mg；对rAFO进行酶学性质分析表明,对于底物黄曲霉毒素B,rAFO的Km值为3.93士0.20×10-6 mol/L;反应最适温度为30℃,最适pH为6.0；30℃放置90 min后酶活力下降50％；rAFO在pH5.5 - 7.0之间酶活力较稳定,相对活力维持在51％ -65％之间.[结论]本文第一次成功克隆并重组表达了一种具有黄曲霉毒素B1转化功能的酶——黄曲霉毒素氧化酶( aflatoxin-oxidase,AFO),纯化后的重组AFO(rAFO)具有较好的黄曲霉毒素B1转化活性,为进一步研究和应用奠定了基础.
假蜜环菌、黄曲霉毒素氧化酶、cDNA末端快速护增、毕赤酵母
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Q814(生物工程学(生物技术))
the National High Technology Research and Development Program of China2005AA213010;the National Natural Science Foundation of China30270043
2011-12-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
1212-1221
