高效表达N-乙酰高丝氨酸内酯酶-木聚糖酶融合蛋白及其酶学性质
[目的]构建N-乙酰高丝氨酸内酯酶-木聚糖酶双酶活性表达毕氏酵母重组菌株,并对经纯化的重组蛋白SL2B进行N-乙酰高丝氨酸内酯酶及木聚糖酶酶学性质的研究.[方法]利用PCR拼接技术得到N-乙酰高丝氨酸内酯酶基因aiiA-B546和木聚糖酶基因xynAS27cd融合而成的基因S12b.构建重组表达载体pPIC9/S12b转化毕氏酵母,筛选得到同时具有木聚糖酶和N-乙酰高丝氨酸内酯酶活性的重组子,随后对经硫酸铵沉淀、分子筛纯化后得到的重组蛋白SL2B进行N-乙酰高丝氨酸内酯酶及木聚糖酶酶学性质的研究.[结果]筛选得到N-乙酰高丝氨酸内酯酶和木聚糖酶均可高效表达活性的毕氏酵母重组菌株.纯化后的融合蛋白中N-乙酰高丝氨酸内酯酶的最适作用pH为8.0,作用温度为30℃,在pH 6-11的范围内能够稳定的存在,在0℃-50℃之间,酶活性能够维持在80％以上,且该酶对多种金属离子、化合物和中性蛋白酶都具有很好的抗性.该融合蛋白对多种底物都具有一定的降解作用,以3-oxo-C8-HSL为底物时的Km值为0.05 mmol/L.木聚糖酶的最适pH为6.5,最适作用温度为60℃,在pH 6-8的范围内能够稳定的存在,在50℃-65℃之间,酶活性能够维持在80％以上,且该酶对多种金属离子、化合物和中性蛋白酶都具有很好的抗性,以燕麦木聚糖为底物时的Km值为2.9 mg/L.在30℃、中性条件下融合蛋白对动物(鱼)肠道环境具有很好的抗性.[结论]本实验选取的木聚糖酶基因具有一个强启动子,可高效表达,通过融合表达的方式带动N-乙酰高丝氨酸内酯酶的高效表达；木聚糖酶具有易检测的优点,通过融合表达简便N-乙酰高丝氨酸内酯酶的活性检测；同时构建的融合蛋白SL2B中木聚糖酶及N-乙酰高丝氨酸内酯酶性质与单酶相比不受影响,在控制外源性病原菌毒性效应及缓解饲源性抗营养因子危害、维护畜禽(水产)消化道健康方面具有一定的应用前景.
高丝氨酸内酯酶、木聚糖酶、融合表达、酶学性质
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Q814(生物工程学(生物技术))
科技部农业科技成果转化资金项目2010GB23260591;中国农业科学院饲料研究所所长基金2009;中国博士后科学基金20090450472
2011-12-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
1052-1061
