洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的基因改造及其在毕赤酵母中组成型和诱导型的表达
[目的]克隆洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶基因,实现其在毕赤酵母中快速、安全和稳定性的大量表达.[方法]首先设计引物扩增B.cepacia脂肪酶基因,然后应用生物信息学方法分析B.cepacia和毕赤酵母整体密码子使用情况、脂肪酶基因信号肽及密码子偏好性.在此基础上,运用overlap PCR对脂肪酶基因中低使用频率密码子进行改造并同时降低基因的G+C含量,获得优化的脂肪酶基因.再分别把原始和优化的脂肪酶基因导人载体pG-APZα和pPIC9K中,获得组成型表达载体pGAPlipW、pGAPlipO和诱导型表达载体pPIClipW、pPIClipO.分别将所得4种载体转入GS115中,得到一系列工程菌.经发酵和NTA树脂纯化后,对脂肪酶的酶学性质进行了初步研究.[结果]4种工程菌的脂肪酶活力分别为pPIClipW 37.8 U/mL,pPIClipO 129.5 U/mL,pGAPlipW 40.2 U/mL 和pGAPlipO 184.3 U/mL.改造后脂肪酶活力比原始脂肪酶提高了4.6倍.酶学性质研究表明,脂肪酶在60℃时活力最高,在40℃-65℃范围内非常稳定;脂肪酶最适pH值为9.0,在pH 6.0-pH10.0范围均表现很好的稳定性.[结论]通过overlap PCR改造后的脂肪酶显著提高了其在毕赤酵母中的表达效率,且GAP启动子比AOX1启动子更适合于B.cepacia脂肪酶的表达.大量表达的重组脂肪酶的性质与野生脂肪酶的性质相同,符合生产要求.
洋葱伯克霍尔德菌、脂肪酶、overlap PCR、GAP启动子、AOX1启动子
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Q814(生物工程学(生物技术))
国家"863计划"2006AA020203;2007AA05Z417;2007AA100703;2009AA032232;教育部新世纪人才基金NCET 07 0336;湖北省自然科学基金2008CDB359;2009CDA046
2010-11-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
1194-1201
