扩展青霉脂肪酶基因克隆、密码子优化及表达
[目的]克隆扩展青霉脂肪酶基因,实现具强催化活性的脂肪酶的异源高效表达.[方法]利用RT-PCR扩增扩展青霉CICC 40356脂肪酶(PEL)cDNA序列,利用重叠延伸PCR(Over-lap extension PCR)技术对PEL的10个稀有氨基酸密码子和表达载体pPIC9K α信号肽的9个氨基酸密码子进行了优化,获得了改造过的脂肪酶基因PELM和表达载体pPIC9KM.并构建了带有脂肪酶自身信号肽的pPIC9K-PEL1、pPIC9KM-PELM1、pPIC3.5K-PEL1、pPIC3.5K-PELM1和不带有脂肪酶自身信号肽的pPIC9K-PEL2、pPIC9KM-PELM2六个重组质粒.利用对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)为底物检测工程菌脂肪酶的酶活.在此基础上,对工程菌的酶学性质进行了研究.[结果]扩展青霉脂肪酶基因eDNA序列分析结果表明该序列与已报道PEL cDNA序列仅相差3个碱基,同源性高达99%.6个重组工程菌在甲醇诱导下,均表现出pNPP水解活性,28℃诱导100h时酶活达到最高,发酵上清的酶活分别为3.65 U/mL、30.49 U/mL、90.85 U/mL、212.05 U/mL、15.29 U/mL、76.32 U/mL.SDS-PAGE结果表明重组脂肪酶分子量均约28 kDa.酶学性质研究表明,重组脂肪酶PELM最适温度为35℃,最适pH为9.5,在pH 7.0-10.0范围内该脂肪酶均较稳定,Ca~(2+)和Mg~(2+)对其有激活作用,Fe~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)则有抑制作用,EDTA能使之快速失活.以不同碳链长度的对硝基苯酚酯为底物检测其底物特异性,结果显示其对中链酯(C_8-C_(12))有较强的水解能力,最适底物为为C_8的pNP酯.[结论]密码子优化后的扩展青霉脂肪酶基因在毕赤酵母中获得理想的表达,其酶活力比未优化的野生脂肪酶的提高了2.3-2.5倍,表明定点突变对其基因本身更改特有稀有密码子是实现PEL功能蛋白的异源高效表达的有效策略之一.
扩展青霉脂肪酶、基因克隆、密码子优化、表达
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Q786(基因工程（遗传工程）)
国家高技术研究发展计划863计划2006AA020203;2007AA05Z417;2009AA03Z232;武汉市攻关项目200720422138
2010-04-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共8页
228-235
