黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

摘要：

[目的]以毕赤酵母(Pichia pastoris)KM71为宿主菌表达黑曲霉(Aspergillus niger)SG136 α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase).[方法]以实验室保藏的A. niger SG136总DNA为模板,根据NCBI数据库中A. niger CBS513.88 α-葡萄糖苷酶的cDNA序列(aglu)设计引物,通过PCR和重叠延伸PCR(overlap-PCR)方法,扩增得到aglu,将其克隆到载体pMD18-T simple vector,测序结果表明,aglu编码960个氨基酸.与A. niger CBS513.88 α-葡萄糖苷酶相比仅有一个氨基酸的差异.将得到的aglu亚克隆到质粒pPIC9K,构建表达载体pPIC9K-aglu,经Bgl Ⅱ线性化后电转化P. pastoris KM71,经过MD、YPD/G418平板筛选表型,PCR方法验证,获得分泌表达重组P. pastoris KM71/pPIC9K-aglu.摇瓶培养中通过添加终浓度为1%的甲醇诱导α-葡萄糖苷酶的分泌.[结果]SDS-PAGE显示表达蛋白的大小亚基分子量分别为98 kDa和33 kDa,阴性对照中没有出现此条带,非变性电泳检验为一条带.制备的粗酶液的酶学性质表明,转苷反应最适pH为5,最适温度为55℃.在最适pH和温度下,反应24 h时低聚异麦芽糖的总含量达到最大为26.0%.[结论]黑曲霉α-葡萄糖苷酶在P. pastoris中获得可溶性表达,并证明有一定的转糖苷活性.

关键词：黑曲霉、α-葡萄糖苷酶、克隆、ovedap-PCR、毕赤酵母、表达

所属期刊栏目：49

分类号：Q814(生物工程学(生物技术))

资助基金：国家杰出青年科学基金20625619;食品科学与技术国家重点实验室科研基金SKLF-MB-200802;国家重点基础研究发展规划973计划2007CB 714036

在线出版日期：2009-03-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：262-268