甲基对硫磷水解酶的重组表达及其纯化和性质研究

摘要：

用PCR方法获得甲基对硫磷水解酶编码基因,构建了重组表达质粒pET29a_mpd,将其转化至Escherichia coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,得到C-末端含有6个寡聚组氨酸的甲基对硫磷水解酶,用Ni-NTA亲和层析纯化得到具有活性的甲基对硫磷水解酶.测定了环境因素对酶活性的影响及酶动力学参数.甲基对硫磷水解酶水解甲基对硫磷时,最适pH8.6～8.8,最佳反应温度15℃;Mn2+、Zn2+、Cu2+可使酶活性增加15%～20%,Ca2+、Mg2+微弱地促进酶的作用,Ni2+对酶活性几乎无影响;1mmol/L EDTA*Na2+几乎不影响酶的活性,而10mmol/L EDTA*Na2+对甲基对硫磷水解酶有较强的抑制作用.甲基对硫磷水解酶水解乙基对硫磷时,最适pH8.6.25℃时,该酶对甲基对硫磷的米氏常数Km为(68.6 ± 5.1)μmol/L,kcat为(45 ± 6 )S-1;对乙基对硫磷的米氏常数Km为(59.5 ± 6.0)μmol/L,kcat为(8 ± 1) S-1.kcat/Km表明甲基对硫磷水解酶对甲基对硫磷的催化效率更高.

关键词：甲基对硫磷水解酶、基因表达、Ni-NTA亲和层析、酶活性

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分类号：Q814(生物工程学(生物技术))

资助基金：国家自然科学基金30300005;江苏省自然科学基金BK2001071;国家高技术研究发展计划863计划2001AA246071,2001AA214121;农业部农业科技跨越计划;国家科技攻关项目2002BA516A01

在线出版日期：2004-07-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：356-360