三角酵母D-氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

摘要：

从三角酵母中提取总RNA,反转录后进行PCR扩增得到D-氨基酸氧化酶 (D-Amino Acid Oxidase, DAAO)基因,经测序可知,与文献中三角酵母的DAAO基因序列的同源性在99%以上.将DAAO基因用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后,与相同酶切的大肠杆菌表达载体pET-28a连接,转化大肠杆菌TOP-10F′,并筛选得到重组质粒pET-DAAO,转化BL21(DE3)感受态细胞,得到重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-DAAO.对重组大肠杆菌中的D-氨基酸氧化酶进行了诱导表达,考察了诱导温度、菌浓度、诱导剂IPTG用量以及溶氧等因素对酶活的影响.结果表明,在28℃、菌浓度(OD600)1.0、IPTG浓度1mmol/L时,DAAO酶活最高达23.3U/mL.研究进一步显示,用廉价无毒的乳糖可以替代IPTG进行诱导,当乳糖浓度为2mmol/L,DAAO酶活可达22.7U/mL.经过补料分批培养和乳糖诱导,DAAO酶活可以达到175U/mL.

关键词：D-氨基酸氧化酶、三角酵母、大肠杆菌、乳糖

所属期刊栏目：44

分类号：Q786(基因工程（遗传工程）)

在线出版日期：2004-07-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：336-339