降落PCR及克隆测序法检测DNA甲基化的实验研究

摘要：

目的 探索优化PCR及测序法检测DNA甲基化的实验条件,检测肺癌hsa-mir-34b(mir-34b)基因启动子DNA甲基化谱.方法 肺癌细胞株A549 DNA进行亚硫酸盐处理后,设计引物扩增mir-34b基因启动子序列,使用普通PCR、巢式PCR和降落(Touchdown)PCR方法以及不同DNA聚合酶进行扩增,甲基化谱检测采用PCR直接测序和克隆后测序两种方法.结果 降落 PCR与巢式PCR方法相结合优于普通PCR及单独的巢式PCR或降落 PCR.HotStart酶优于普通Taq酶及Ex Taq酶.直接PCR测序法的测序图普遍出现套峰难以判读,PCR产物克隆后测序可见清晰的测序峰,甲基化位点可明确判读,并可以结合测序克隆数目提高甲基化检测敏感度.结论 对于重亚硫酸盐处理的DNA甲基化状态检测,推荐使用HotStart酶、降落 PCR与巢式PCR相结合、克隆测序法检测基因甲基化谱,序列图明确且敏感度高.

关键词：降落PCR、DNA甲基化、克隆测序

所属期刊栏目：24

分类号：R73-3(肿瘤学)

在线出版日期：2010-09-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：385-389