BLNK基因慢病毒载体构建及其稳定表达的人乳腺癌MDA-MB-231细胞株的筛选

摘要：

目的 构建人BLNK基因慢病毒载体,筛选稳定表达BLNK的人乳腺癌MDA-MB-231细胞株,为探讨BLNK对乳腺癌的调控作用提供细胞株模型.方法 采用PCR法从3×Flag-BLNK质粒中扩增BLNK基因片段,连接到带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的慢病毒载体表达质粒中,与包膜质粒pMD2.G、包装质粒psPAX2共转染293T包装细胞48 h,获得携带FLAG-BLNK的重组慢病毒,同时以慢病毒空载体FLAG-vector作为阴性对照.以重组慢病毒及阴性对照慢病毒分别感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,1周后在高倍镜100×视野下观察被感染细胞数及细胞状态,在荧光显微镜下通过观察GFP的表达情况,筛选稳定表达BLNK的细胞株.采用反转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的方法和Western Blotting法检测该细胞系中BLNK基因的表达情况.结果 PCR成功扩增出BLNK基因片段,插入慢病毒表达载体后,利用核酸序列测定证实重组慢病毒质粒构建成功.通过慢病毒包装三质粒表达系统获得表达BLNK的重组慢病毒,感染MDA-MB-231细胞后,在荧光显微镜下能够明显观察到绿色荧光且细胞形态正常.RT-qPCR检测结果显示,感染表达BLNK慢病毒的MDA-MB-231细胞中BLNK表达水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01).Western blotting检测结果表明,筛选出的GFP阳性的人乳腺癌MDA-MB-231细胞株可过表达BLNK.结论 成功构建了含BLNK基因的慢病毒表达载体,并筛选出稳定表达BLNK的人乳腺癌MDA-MB-231细胞株,为进一步明确乳腺癌的发生、发展机制奠定了基础.

关键词：BLNK、慢病毒载体、乳腺癌、MDA-MB-231

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资助基金：军队后勤科研项目CWH17C017;广州市科技计划项目201804010186

在线出版日期：2018-08-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：2137-2140