siRNA体外合成体系中GMP浓度优化及其对HeLa细胞端粒酶抑制的研究

摘要：

目的 在小片段干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)体外合成的反应体系中加入不同浓度的GMP,比较RNA转录效率的高低,探讨siRNA体外合成体系中GMP的最佳浓度.并以该法合成的siRNA对肿瘤细胞端粒酶基因表达进行RNA干扰来验证其干扰效应.为简便、高效、低成本体外合成制备siRNA提供优化的实验条件,为广泛开展RNA干扰实验打下基础. 方法 以本实验室根据端粒酶hTERT基因(genebank gi:2347128)2653-2673位的核酸序列,构建的末端带T7启动子的部分双链DNA为模板,用T7RNA聚合酶体外合成方法合成siRNA.在siRNA体外合成的反应体系中加入不同浓度的GMP,以分光光度法测定合成的RNA量来比较RNA转录效率的高低;从而确定siRNA体外合成中GMP的最佳浓度.并以磷酸钙共沉淀法将合成的siRNA转染Hela细胞.用TRAP-银染法和PCR-EIA分别检测siRNA转染后的Hela细胞端粒酶活性,以验证其干扰效应. 结果 在T7RNA聚合酶体外转录合成siRNA的反应体系中加入不同浓度的GMP,结果显示以GMP终浓度为5 mM时的RNA转录效率为最佳.用该法合成的siRNA转染Hela细胞后端粒酶表达被抑制. 结论 GMP可提高T7RNA聚合酶体外转录体系的转录效率,本实验研究的反应体系中以5 mM GMP终浓度为其最佳.以该优化法合成的针对端粒酶hTERT的siRNA对端粒酶的表达产生了干扰效应.

关键词：GMP、T7RNA聚合酶、siRNA、端粒酶、TRAP银染

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分类号：R329.2+6(人体形态学)

在线出版日期：2008-09-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共3页

页码：663-665