再生基因4(REG4)真核表达载体的构建及其蛋白在HEK 293T细胞中的表达、纯化

摘要：

目的 构建再生基因 4(regenerating gene 4,REG4)的真核表达载体,转染人胚肾细胞 293T(human embryonic kidney 293T cells,HEK 293T),获得重组人再生胰岛衍生蛋白IV(regenerating islet-derived protein IV,Reg IV).方法 根据 NCBI 数据库REG4 基因序列进行基因优化、合成,将其克隆至pCDNA3.4 载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pCDNA3.4-REG4 质粒瞬时转染至HEK 293T细胞(实验组),同时以pEGFP-C1 质粒作为转染对照组,未转染重组质粒的HEK 293T细胞作为空白对照组.荧光显微镜观察转染对照组转染效率,分别收集实验组及空白对照组细胞和细胞培养液上清,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)与免疫印迹试验(Western-Blot,WB)检测Reg IV蛋白表达水平.通过镍柱及丙烯葡聚糖凝胶 S-400(Sephacryl S-400)柱进行蛋白纯化,SDS-PAGE及WB对纯化后重组蛋白进行鉴定.结果 经测序和双酶切鉴定,重组质粒pCDNA3.4-REG4 构建成功.转染对照组(pEGFP-C1 质粒)荧光显微镜观察结果显示转染效率约 50%,表明转染成功.WB结果显示仅在实验组(pCDNA3.4-REG4 质粒)的细胞中检测到Reg IV蛋白.镍柱纯化时目的蛋白无法与镍柱填料有效结合,Sephacryl S-400凝胶柱层析纯化获得了此重组蛋白.结论 成功构建了REG4 基因真核表达载体并在HEK 293T细胞中成功表达,为深入研究Reg IV蛋白的作用机理及开发潜在的抗癌靶向药物奠定了基础.

关键词：再生基因4、再生胰岛衍生蛋白IV、真核表达、人胚肾细胞293T、瞬时转染、蛋白纯化

所属期刊栏目：38

分类号：Q786(基因工程（遗传工程）)

资助基金：兰州市科技发展指导性计划项目;甘肃省自然科学基金

在线出版日期：2023-08-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：35-39