嗜热菌ToPif1解旋酶与G四链体的互作活性位点预测及鉴定

摘要：

利用AlphaFold2人工智能程序在原子水平预测并验证嗜热菌T hemus oshimai Pif1(ToPif1)解旋酶参与特殊核酸二级结构G四链体(G4)解旋的关键活性位点.采用变温圆二色光谱测试及解旋实验确定ToPif1解旋酶的嗜热特性;利用AlphaFold2程序预测ToPif1与G4 DNA的互作氨基酸位点,并应用分子生物学工具将预测互作位点分别突变为丙氨酸;通过原核表达系统获得ToPif1的单点突变体蛋白,突变体蛋白经ATP水解实验验证后发现其基本活性不受损;通过荧光各向异性实验和荧光共振能量转移偶联快速停留技术对比ToPif1野生型和突变体对不同构型G4 DNA的结合活性及解旋活性差异,确认影响ToPif1结合和解旋G4的关键氨基酸位点.结果表明:ToPif1解旋酶在高温下仍可保持蛋白构象及解旋活力;预测结果显示ToPif1上存在8个与G4互作的潜在位点,且这些位点的单点突变均不会破坏ToPif1的ATP水解活力;在ToPif1结合G4CEB和G4Tel中发挥关键作用的氨基酸位点是R355,而显著影响ToPif1解旋G4活力的位点是R135和R355.研究结果明确了具有嗜热特性的ToPif1发挥结合、解旋G4 DNA活性的关键氨基酸位点,为理解嗜热菌Pif1解旋酶识别与解旋G4 DN A的机理提供了参考.

关键词：解旋酶、活性位点、AlphaFold2结构预测、G四链体、Pif1家族

所属期刊栏目：50

分类号：Q812(生物工程学(生物技术))

资助基金：国家自然科学基金;国家自然科学基金

在线出版日期：2022-09-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：99-107