基于微量DNA样本的简化甲基化文库构建方法研究

摘要：

RRBS(简化甲基化测序)是一种有效研究DNA甲基化状态的测序方案.文库构建是该方案中最关键的实验步骤之一,RRBS文库构建往往因为酶切产物少,文库构建步骤繁多等因素,导致DNA起始量需要1 ug以上.然而很多来源于人的样本,如冰冻组织穿刺、石蜡切片、显微微切割等,都往往只能获得100 ng以下的DNA,无法满足常规RRBS文库构建的起始DNA总量要求,从而大大限制RRBS技术的应用范围.本研究主要探讨并设计了基于微量DNA样本(<100 ng)的RRBS文库构建策略,主要通过优化MspI酶切条件、DNA片段大小筛选、缩减反应步骤及减少DNA转移次数等技术手段,大大提高了DNA回收率,进而建立了2种有效使用微量DNA样品的RRBS文库构建方案(即EA-Method和WB-Method方案).EA-Method方案在处理100 ng左右的DNA时,有经济、快速、高效的特点,但文库质量略差于WB-Method方案;WB-Method方案可将DNA起始量降低至10 ng,并且文库质量高.为验证WB-Method方法的可靠性,研究人员选取了3种志愿者样本(全血和口拭子),采用WB-Method同时进行常量和微量RRBS文库构建,并进行Illumina Hiseq平台测序,数据通过生物信息分析得到微量RRBS检测的CpG,CHG,CHH中C碱基的甲基化比例与常量RRBS结果一致.同时,该方法可以大大降低DNA损耗及损伤,因而该方法可将RRBS技术应用到更广泛的样本类型中去,有效拓展RRBS的研究领域.

关键词：二代测序、RRBS、简化甲基化、EA-M、WB-M

所属期刊栏目：15

分类号：Q78(基因工程（遗传工程）)

在线出版日期：2017-05-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共13页

页码：33-45