基于CRISPR/Cas9技术的HaCaT的TLR4基因定向敲除及其功能初步研究

摘要：

[目的]构建敲除Toll Like Receptor4(TLR4)基因的HaCaT细胞株,为后续利用该细胞株进行过敏原性研究提供材料.[方法]利用CRISPR/Cas9系统,根据靶向原理设计并合成4条特异性识别TLR4基因的向导RNA(single-molecule guide RNAs,sgRNAs),构建pX459-sgRNAhTLR4重组质粒,并转入HaCaT中,用嘌呤霉素筛选出单克隆阳性细胞.测序确认突变位点,然后利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激对TLR4进行功能验证来进一步确认敲除效果.[结果]测序结果表明#26单克隆细胞株在靶点附近缺失1 bp,造成TLR4编码基因的移码突变,蛋白翻译提前终止.功能性验证结果表明,在LPS的刺激下,IL-8和CCL20的mRNA水平分别下降约85％和90％,且IL-8的蛋白分泌水平也显著性下调(87％).[结论]成功构建了敲除TLR4的稳定细胞株,并且验证TLR4的功能缺损.

关键词：CRISPR/Cas9系统、TLR4基因、基因敲除、HaCaT细胞株

所属期刊栏目：29

分类号：Q789(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家科技重大专项;国家科技重大专项;广州市过敏反应临床医学研究与转化中心建设项目

在线出版日期：2019-04-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：57-62,102