信号转导和转录激活因子3调节肿瘤坏死因子α表达的结合位点研究
脓毒症早期内毒素(脂多糖,LPS)可激活丝裂原活化蛋白激酶通路,诱导肿瘤坏死因子α(TNF-α)等多种炎性细胞因子大量生成.TNF-作为一种重要的早期炎症介质,间接激活Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)通路.STATs 活化后直接进入核内参与LPS诱导的基因表达.本研究拟探讨STAT3在TNF-α启动子上的作用位点,为深入认识JAK/STAT信号通路在脓毒症发生中的分子基础及其干预途径提供理论依据.a.将Flag-STAT3与全长TNF-α启动子报告基因共同转染COS-7细胞,观察STAT3作用的剂量-效应.结果证实,STAT3对TNF-α基因的表达不受LPS调节,无论是否有LPS刺激,随着STAT3剂量的增加,TNF-α基因的表达亦随之增加.在将200 μg/L浓度的Flag-STAT3质粒分别与不同长度的TNF-α启动子报告基因质粒共同转染COS-7细胞并用LPS刺激,观察不同片段的TNF-α启动子活性.结果发现,95 bp片段的TNF-α缺失突变体作用最为明显,增加了6.9倍.b.分别构建了70bp、75bp、80bp和85 bp片段的TNF-α缺失突变体-pTNF-α(70 bp)、pTNF-α(75 bp)、pTNF-α(80 bp)和pTNF-α(85bp),将它们与Flag-STAT3共同转染COS-7细胞并用LPS刺激,观察到85bp片段的活性与95 bp片段相似,当片段到达80 bp时,活性降低到对照水平.为了进一步了解其精确结合位点,将85 bp片段突变体的81和82位碱基突变,检测其对TNF-α活性影响,发现启动子活性下降.c.为了证明STAT3的潜在结合位点在80 bp到85 bp之间,且81和82位这2个位点的突变确实改变了STAT3对TNF-α启动子活性,进行凝胶迁移阻滞实验,观察到TNF-α启动子62～85 bp的野生型γ-32p标记的探针可以与核蛋白STAT3结合,而突变的62～85 bp标记的探针不能与核蛋白STAT3结合.上述结果表明,STAT3对TNF-α基因表达的调节不依赖LPS的刺激,STAT3在TNF-α启动子的潜在结合位点是在80到85碱基片段之间.
信号转导及转录激活因子3、肿瘤坏死因子α、脂多糖
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R374;R392.3(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)
国家自然科学基金;国家重点基础研究发展计划（973计划）
2012-03-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
1145-1152
