单活性结构域T7核酸酶Ⅰ的制备及性质研究

摘要：

T7核酸酶Ⅰ(T7E Ⅰ)是一种能特异识别并拆分重组中间体Holliday Junction(HJ)的多功能核酸酶,该酶不仅能特异识别和拆分HJ,而且能随机切刻双链DNA,特异识别并切割双链DNA中的切刻和单碱基错配位点.构建了两种原核表达载体用于表达MBP和His-tag融合的两种T7E Ⅰ突变体,MBP-T7E Ⅰ(E20K)和His6-T7E Ⅰ(E65K).每一种融合蛋白形成的同源二聚体不具有核酸酶活性,通过共表达或两种蛋白质共变性复性、双标签亲和纯化,最终获得具有单个活性结构域的T7E Ⅰ异源二聚体(T7E Ⅰ-SAD).以pUC(AT)和pUC19为底物测试T7E Ⅰ-SAD的HJ拆分活性、随机切刻活性和切刻位点切割活性,结果显示,T7E Ⅰ-SAD可特异识别并切刻HJ结构,但丧失了同时引入两个切刻位点的能力,其对pUC(AT)的特异切刻活力和对pUC19的随机切刻活力与野生酶相当.逐级变性梯度洗脱实验显示,T7E Ⅰ-SAD的稳定性与野生型酶接近,二聚体解离需要5.0～6.0 mol/L尿素或1.75～2.0 mol/L盐酸胍;凝胶阻滞实验表明T7E Ⅰ-SAD具备与HJ结构特异结合的能力.为具有细胞毒性蛋白的表达提供了一种新策略,同时提供了一种简便直观的蛋白质二聚体稳定性测试方法.

关键词：T7核酸酶I、结构域交换、单活性结构域、二聚体稳定性、催化特性

所属期刊栏目：37

分类号：Q55(酶)

资助基金：西北农林科技大学青年学术骨干支持计划QN2009070

在线出版日期：2010-06-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：426-432