睾酮假单胞菌3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建及表达

摘要：

从土壤中分离睾酮假单胞菌,提取其基因组DNA,PCR扩增3a-羟类固醇脱氢酶(3α-hsd)基因,将扩增产物用Nde Ⅰ/BamHⅠ消化,切下目的基因片段克隆到质粒pET-15b中构建重组pET-15b.将重组pET-15b转化入E.coli DH5a中,经酶谱分析和测序,鉴定出正确的重组质粒pET-15b.将重组pET-15b转化入宿主菌E.coli BL21(DE3)pLysS中,用硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达.提取细菌总蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析并测定酶活性.粗提物中酶活性高达2.45×105 U/L.利用重组蛋白中的6个组氨酸(His)组成的"标签"进行亲和层析,经一步金属螯合亲和层析纯化后,重组蛋白在SDS-PAGE上呈现出均一的单一条带,回收率达68%.活性和纯度均较高的目的蛋白3α-HSD的获得,为血清总胆汁酸酶循环法测定奠定了基础.

关键词：睾酮假单胞菌、3α-羟类固醇脱氢酶、重组质粒、基因表达、胆汁酸

所属期刊栏目：29

分类号：R446.1(诊断学)

在线出版日期：2004-01-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：966-969