谷氨酸依赖型氨基转移酶的高通量筛选方法及其应用

摘要：

目的:建立谷氨酸依赖型氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应的96孔板高通量筛选方法,并用于大肠杆菌氨基转移酶WecE突变库的筛选.方法:通过优化偶联指示酶-谷氨酸脱氢酶、信号分子NADH浓度及双酶偶联反应时间,建立了光学法测定氨基转移酶活性的氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应方法;通过定点饱和突变技术构建了大肠杆菌氨基转移酶WecE的突变库;采用96孔板高通量初筛、摇瓶复筛获得了高活性的转氨酶突变体,并对纯化的突变体进行催化活力分析.结果:建立了谷氨酸依赖型氨基转移酶目标反应与0.5 U/ml L-谷氨酸脱氢酶和0.4 mmol/LNADH信号指示反应相偶联的筛选方法;构建了氨基转移酶WecE Tyr 321饱和突变库,通过96孔板高通量筛选,获得了催化活性比野生型提高3.4倍的突变体Y321F.结论:所建立高通量筛选方法背景干扰小,准确性高,为谷氨酸依赖型氨基转移酶分子进化提供了可行性方案.

关键词：谷氨酸依赖型氨基转移酶、L-谷氨酸脱氢酶、高通量筛选、分子改造

所属期刊栏目：37

分类号：Q819(生物工程学(生物技术))

资助基金：国家“973”计划资助项目2012CB721000

在线出版日期：2017-10-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：59-65