重组抗凝蛋白-新蛭素的原核表达研究

摘要：

目的:重组新蛭素(EH)是在抗凝蛋白水蛭素的氨基末端添加3个氨基酸(EPR)的衍生物,以往EH的表达工艺沿用水蛭素的酵母表达工艺,生产周期长、目标蛋白表达效率相对较低.而水蛭素类的蛋白在大肠杆菌中往往以包涵体形式表达,后期的分离纯化收率较低,无法适应产业化.为了提高EH的生产效率,探索了EH在大肠杆菌中的可溶性表达.方法:首先通过PCR的方法获得eh的cDNA,PCR产物连接入原核表达载体pET-22或pET-24中获得重组表达质粒,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或BL21 (plySs),获得重组工程菌BL21(DE3)-pET-24-eh,BL21(DE3)-pET-22-eh,BL21 (plySs)-pET-22-eh.重组工程菌进行IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果:EH在3个重组工程菌中均可实现可溶性表达.表达水平较高的为BL21(DE3)-pET-24-eh工程菌;之后通过优化诱导温度,时间,诱导剂浓度、诱导前菌种密度,确定最佳条件为:37℃,诱导6h,IPTG浓度为0.4 μmol/L,诱导前菌种密度在OD600=1左右.诱导产物经分离纯化,其纯度可达96.93％.最后通过蛋白含量测定及抗凝活性检测,确定表达的EH蛋白本身无抗凝活性,被FXa裂解后可以释放出水蛭素的抗凝活性.结论:实现了EH在大肠杆菌中的可溶性表达,表达周期短,有望提高EH的生产效率,为EH的产业化奠定了基础,也为水蛭素类产品的生产提供了新的工艺途径.

关键词：新蛭素、原核表达、可溶性表达、抗凝

所属期刊栏目：34

分类号：Q786(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家科技重大专项“重大新药创制”2012ZX09102301-008资助项目

在线出版日期：2015-01-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：69-77