基于CRISPR/Cas9系统构建精准调控Wnt信号通路的表达载体及其效果的验证

摘要：

目的:构建基于CRISPR/cas9系统调控Wnt信号通路的载体,并在细胞水平验证其调控基因表达的效率.方法:选取Wnt信号中负性调控分子,设计并合成能够表达靶向上述分子gRNA的互补DNA克隆序列,BsmBI限制性内切酶酶切载体后,采用分子克隆的方法将上述序列克隆至目的载体lenti-sgRNA-Ms2-zeo,测序正确的克隆通过Lipofectamine2000与lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine共同转染入293细胞;转染24h后收集细胞,qRt-PCR检测目的基因的表达.结果:筛选了Wnt信号通路中已知的19个负性调控基因;针对每个基因设计了两对gRNA序列,并构建了能够表达gRNA和MS2融合序列的载体,测序结果显示重组质粒的DNA序列与预期完全相符.随机挑选了4个表达载体与lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine共转进入细胞,qPCR结果显示构建的目的载体联合lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine载体可以协同促进靶分子表达.结论:本研究成功构建了基于CRISPR/cas9基因编辑系统调控Wnt信号的载体.

关键词：CRISPR/cas9、gRNA、质粒重组、基因表达、Wnt信号通路

所属期刊栏目：16

分类号：R-33;Q78;R541.4(医学研究方法)

资助基金：国家自然科学基金项目31100979,81570232

在线出版日期：2016-12-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：6031-6037