慢病毒介导的HTRA1基因稳定过表达人脑血管平滑肌细胞株的建立

摘要：

目的:构建并包装针对HTRA1基因以及其1091T＞C突变基因(HTRA1-Mut)的过表达慢病毒载体,以及建立稳定表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的人脑血管平滑肌细胞(HBVSMC)株.方法:采用RT-PCR方法扩增HTRA1及HTRAl-Mut基因片段并将其连接于GV287载体质粒,采用慢病毒包装三质粒系统(GV287/pHelper l.0/pHelper 2.0)转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液并标定病毒滴度,慢病毒感染经培养和鉴定的HBVSMC细胞株.结果:成功构建含HTRA1及HTRAl-Mut基因的慢病毒重组载体,PCR鉴定阳性的克隆进行测序和BLAST比对分析显示与源基因序列一致,并能够有效的感染并在293T细胞中表达.表达载体包装后测定病毒滴度为:2E+8 TU/mL.过表达慢病毒感染后HBVSMC有荧光表达,并且荧光率达80％以上,细胞生长良好传后细胞几乎无死亡现象.结论:成功构建了过表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的慢病毒表达载体,得到了较高滴度的病毒悬液,建成了稳定表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的HBVSMC细胞株,为进一步探讨HTRA1基因及突变后细胞的功能变化提供了良好的研究工具.

关键词：慢病毒表达载体、HTRA1、CARASIL、人脑血管平滑肌细胞

所属期刊栏目：16

分类号：R-33;Q75;Q78(医学研究方法)

资助基金：国家自然科学基金面上项目81271318

在线出版日期：2016-06-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：2218-2222