miR-217慢病毒表达载体及稳转胶质瘤细胞系的构建

摘要：

目的:构建miR-217慢病毒表达载体并建立稳定表达miR-217的胶质瘤细胞系,为深入研究miR-217在胶质瘤细胞生长及功能中的作用及机制提供条件.方法:利用人基因组中miR-217前体序列,设计并合成引物.采用PCR的方法扩增含miR-217前体的目的片段,酶切后连接至慢病毒表达载体pLVX-EGFP-Puro.将带有miR-217前体的慢病毒载体及辅助质粒用脂质体的方法转染293细胞,24小时后收集上清液测定病毒滴度.利用实时定量PCR检测miR-217的表达水平,确定慢病毒载体的表达能力.将病毒感染胶质瘤细胞系U251,通过荧光观察和嘌呤霉素(Puromycin)筛选,获得稳定转染miR-217的胶质瘤细胞系.结果:克隆的miR-217前体目的片段经PCR检测和测序分析,序列完全正确、无突变.实时定量PCR检测发现慢病毒感染293T细胞后,miR-217的表达水平明显升高(P＜0.01),表明miR-217慢病毒表达载体构建成功.经嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜观察发现细胞均有稳定的绿色荧光表达,并且miR-217的表达水平显著升高(P＜0.01),是对照组的12.5倍.结论:成功构建了miR-127慢病毒表达载体和稳转胶质瘤细胞系,为后续研究奠定了良好基础.

关键词：miR-217、胶质瘤细胞、慢病毒、基因表达

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分类号：Q78;R739.4(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家留学基金项目201303810388;上海市自然科学基金项目12ZR1424900;上海交通大学附属第一人民医院“优秀青年人才”基金

在线出版日期：2015-08-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：2625-2628