DPC4/Smad4基因RNA干扰靶点设计和慢病毒载体制备

摘要：

目的:DPC4/Smad4基因RNA干扰靶点的设计和RNA干扰靶点慢病毒载体制备.方法:针对DPC4/Smad4基因序列,并利用网站设计程序,依据RNA干扰序列设计的原则,设计多个RNA干扰靶点序列.根据设计经验和设计软件将其进行评估测定,选择最佳动力学参数靶点进入其后续的实验流程;生工生物合成含干扰序列的DNA oligo,具有严格的检测体系(PAGE纯化体系),其两端含酶切位点粘端,直接连入酶切后的RNA干扰载体上.将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞,并且对长出的克隆进行酶切鉴定.然后挑选出阳性克隆测序,进行测序比对后,鉴定阳性的克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰慢病毒载体.将构建的慢病毒载体以及辅助包装载体质粒共转染到293T细胞.收获含有病毒的细胞培养上清,浓缩后进行滴度测定,并检测其感染性.另外应用荧光实时定量PCR检测在感染的293T细胞中敲减效果.结果:成功构建DPC4/Smad4 shRNA的慢病毒载体LVshSmad4,并成功制备DPC4/Smad4 shRNA慢病毒,三株病毒感染细胞后均具有有效的敲减效应,其中SH1最为显著.结论:DPC4/Smad4基因RNA干扰靶点的成功设计和RNA干扰靶点慢病毒制备,为以后探讨DPC4/Smad4基因与肿瘤的相关性治疗提供了实验基础.

关键词：DPC4/Smad4、RNA干扰、慢病毒

所属期刊栏目：14

分类号：Q75;Q78(分子遗传学)

资助基金：国家自然科学基金项目81173599

在线出版日期：2014-04-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：1456-1459