Visfatin ShRNA腺病毒载体的构建及对细胞表达的影响
目的:Visfatin是由内脏脂肪细胞分泌的一种脂肪细胞因子,它能够发挥拟胰岛素作用,并能促进脂肪细胞的分化、合成及积聚,与糖脂代谢有着密切的联系,但其确切生理功能及作用机制仍有待进一步研究.本实验成功构建了visfatin ShRNA腺病毒载体,并验证其对Hepal-6细胞visfatin mRNA表达的影响.旨在为进一步研究visfatin在影响糖脂代谢方面的作用机制提供一个简便可行的分子生物学研究平台.方法:将前期构建的pGenesil l.2-visfatin质粒双酶切,得到目的片段mU6-visfatinShRNA,克隆入穿梭质粒pShuttle-Basic-EGFP,I-CeuI+I-SceI双酶切后转入pAdxsi载体,经筛选、鉴定后,通过脂质体转染HEK293细胞,包装后得到腺病毒Adxsi-GFP-mU6-visfatin,病毒颗粒法(viral particle,vP)和半数组织感染量法(50％tissue culture infective dose,TCID50)测定其滴度.感染hepal-6细胞后,实时定量PCR检测visfatin的mRNA表达.结果:经酶切及测序鉴定,结果与预期一致.VP法检测病毒滴度为3.20× 1012 VP/mL,TCID50法测得滴度为2× 1011PFU/mL.重组病毒感染后,对小鼠Hepal-6细胞visfatin基因mRNA表达抑制率＞70％.结论:成功构建了visfatin ShRNA重组腺病毒载体,并能有效抑制小鼠Hepal-6细胞visfatin基因表达,为后期进一步研究visfatin在糖脂代谢方面的作用机制提供了一个基因表达下调的生物学模型.
visfatin、腺病毒载体、RNA干扰、Hepal-6细胞
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Q75;Q78(分子遗传学)
国家自然科学基金项目30871199,81070640,81270913;教育部博士点基金20105503110002;重庆市自然科学基金重点项目cstc2012jjB10022
2013-07-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共5页
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