MIR-122慢病毒表达载体构建及稳定转染HepG2细胞系
目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系.方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中.对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR- 122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化.通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,western blot检测mir- 122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR- 122在HepG2细胞中的表达效果.结果:pGCSIL-GFP-miR- 122经双酶切分析及测序,插入序列正确.qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高.表明mir- 122慢病毒表达载体构建成功.流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90％以上.Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达.进一步验证pGCSIL-GFP-miR- 122在细胞中的稳定表达.结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir- 122在人体所起的作用及功能机制打下基础.
microRNA、mir-122、慢病毒表达载体、稳定转染、HepG2细胞
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Q75;Q78(分子遗传学)
国家自然科学基金项目30770959
2012-09-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
1849-1852
