N-糖基化改造提高Aspergillus fumigatus生淀粉糖化酶的催化效率

摘要：

生淀粉糖化酶(raw starch glucoamylase,RSGA)可以直接作用于未糊化淀粉颗粒.该研究基于Aspergil-lus fumigatus来源RSGA氨基酸序列分析发现,Asn121、Asn422和Asn610位点均为Asn-Xaa-Ser形式的糖基化基序,具有将其突变为Asn-Xaa-Thr形式糖基化基序的潜力.首先,利用NetNGlyc 1.0 Server评估突变序列N-糖基化的可能性,并获得 突变体 S123T(Asn121-Pro122-Thr123)、S424T(Asn422-Gly423-Thr424)和 S612T(Asn610-Arg611-Thr612).突变体在Komagataella phaffii中表达并完成糖基化,利用去糖基化酶EndoH处理进一步验证突变体均成功被糖基化.在此基础上,以生玉米淀粉为底物,在40 ℃,pH 4.6的条件下分析了突变体S123T、S424T和S612T的催化效率(kcat/Km),分别是RSGA的1.31、1.29和1.15倍,这主要是由于Km值降低导致突变体对底物的亲和力增加造成的.此外,蛋白浓度及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析显示突变体S123T表达量提高了 9.3％,且糖基化效果显著.酶学性质分析结果显示,重组酶的最适反应温度从70 ℃降低到60℃.研究结果表明,N-糖基化基序改造是一种有效的提高RSGA的催化效率的策略.

关键词：生淀粉糖化酶、生玉米淀粉、Komagataella phaffii、N-糖基化、催化效率

所属期刊栏目：49

分类号：Q936;TQ464.9;S

资助基金：国家重点研发计划2019YFA0706900

在线出版日期：2023-10-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

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