大肠杆菌必需基因的CRISPR-Cas9敲除策略及高效质粒置换方法

摘要：

由于必需基因的功能必须性使其难以从基因组上被删除,而此前报道的方法存在效率低、非无痕敲除等缺点.基于此,该文建立了一种基于 CRISPR/Cas9 的基因组必需基因高效无痕敲除方法.以大肠杆菌 metK基因(编码 S-腺苷甲硫氨酸合酶)为例,首先将 metK基因克隆至质粒 pTarget-metK,并采用定点突变方式将 metK基因进行同义突变移除对应的 PAM 序列,构建获得质粒 pHL3.进一步构建含有与 pHL3 相同 metK 的回补质粒,pCas、pHL3 及回补质粒依次转化即可完成基因组必需基因的高效无痕敲除.该方法对必需基因 metK 编辑时编辑效率可达 100%.为了研究必需基因的酶学性质改变对宿主代谢的影响,探索了基于质粒不相容及 Flp/FRT系统对回补质粒的置换效率,发现基于 Flp/FRT 系统可实现回补质粒高效置换.生长测试表明携带 metK野生型或是 PAM 位点突变的 metK编辑菌株与野生型菌株在 LB 培养基和 M9 培养基中生长无明显差异,而对L-甲硫氨酸亲和力下降 MetK突变体则表现明显的生长延滞.

关键词：必需基因、CRISPR/Cas9、基因编辑、质粒置换、无痕敲除

所属期刊栏目：49

分类号：Q78;S828;R392

资助基金：国家自然科学基金;国家自然科学基金

在线出版日期：2023-10-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：17-23