PMA-qPCR定量检测VBNC副溶血弧菌方法的建立与优化

摘要：

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)在某些不利于生长的自然和食品加工条件下能够进入活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态,普通检测方式极易漏检,因此VBNC细菌检测技术的开发与优化对副溶血弧菌感染防控具有重要意义.基于叠氮溴化丙锭结合荧光定量PCR技术(propidium monoazide quantitative PCR,PMA-qPCR)能够利用活细胞的膜完整性区分活菌和死菌的原理,以副溶血弧菌ATCC 17802为对象,通过探讨PMA-qPCR方法中各项因素对活菌计数结果的影响,优化并建立了VBNC副溶血弧菌的定量检测方法.实验结果表明,当添加PMA质量浓度为15 mg/L,黑暗孵育10 min,再进行强光照射15 min后,死细胞的DNA扩增得到有效抑制,此时提取DNA模板进行qPCR扩增准确性更高,活菌数与qPCR扩增循环数呈现显著性线性相关(R2=0.99).PMA-qPCR法测定副溶血弧菌活菌数的标准曲线显示该方法检测范围为2.90×101～2.90×108 CFU/mL,验证回收率在92.97％ ～99.57％,相对标准偏差为1.95％.该文建立了更加精准可靠的VBNC副溶血弧菌定量检测方法,为后续进一步探究提供了有效技术手段.

关键词：副溶血弧菌;活菌计数;叠氮溴化丙锭;荧光定量PCR;活的非可培养

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资助基金：国家重点研发计划;现代农业产业技术体系

在线出版日期：2022-01-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：247-252