抗克伦特罗核糖体展示单链抗体文库的构建及鉴定
构建大容量核糖体展示抗克伦特罗单链抗体（single-chain fragment variant,scFv）文库,为进一步筛选抗体奠定基础。用克伦特罗人工抗原免疫小鼠,分离其脾细胞;Trizol法抽提总RNA,反转录成cDNA,PCR及重叠延伸PCR法构建核糖体展示scFv文库。再通过PCR和重叠延伸PCR在scFv文库序列5＇端添加T7启动子、茎环结构、核糖体结合位点,3＇端添加间隔区序列（T20-V109）、茎环结构构建核糖体展示抗克伦特罗scFv文库。核糖体展示scFv文库与Easy T3载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选,挑取5个阳性克隆双酶切和测序鉴定。结果表明：用于建库材料的免疫小鼠效价为1：128000;成功扩增重链可变区基因大约为360bp和轻链可变区基因大约为330pb;核糖体展示scFv文库基因大约1200bp;库容量达1.75×1013;阳性重组质粒均含有1200bp插入片段;利用IMGT/V-QUEST数据库对单链抗体可变区进行序列分析结果表明,重链可变区和轻链可变区基因均由胚系基因重排得到,且与鼠源胚系基因同源率都达84%以上;氨基酸序列比对结果表明,重链可变区氨基酸序列同源率为37.82%,轻链可变区氨基酸序列同源率为39.09%。其中多样性主要发生在VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。成功构建了大容量抗克伦特罗单链抗体核糖体展示文库。
核糖体展示、克伦特罗、单链抗体文库
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Q812(生物工程学(生物技术))
国家自然科学基金30871755;20877029
2012-04-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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