蛋白质工程改造磷脂酶D提高磷脂酰丝氨酸产量

摘要：

为了进一步提高磷脂酰丝氨酸(PS)产量,将来源于Streptomyces katrae的野生型磷脂酶D(SkPLD)于E.coliBL21(DE3)中进行异源表达,获得菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-SkPLD,以磷脂酰胆碱(PC)和L-serine为底物,发现限制PS产量进一步提高的限制因素是转磷脂酰反应转化率低(＜35％)而水解反应转化率过高(＞30％).在对SKPLD结构进行详尽分析的基础上,通过蛋白质工程改造策略扩大底物催化通道,降低位阻效应;同时提高His462与L-serine的亲和力,降低水解反应.结果 表明,获得4个有益单突变体(Y405A、Q407G、D370P、K478P),对其进行组合突变,获得四突变体SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P,转化率、PS产量、kcat/Km分别为55.6％、42.3 g·L-1、1.53 (mmol/L)-1s-1,比野生型分别提高了59.8％、59.6％、93.7％.PS产量进一步提高的原因在于四突变体催化腔体积扩大到718.6 A3,且His462 N原子与L-serine O原子的催化距离(d1)缩短0.6 (A),与H2O O原子的距离(d2)增加0.8 (A).在3L规模转化体系中,PS产量为50.4 g·L-1、转化率达到66.3％,时空产率为12.6 g/L/h.本研究利用蛋白质工程改造获得了转磷脂酰活性提高的突变体,为提高磷脂酶D的工业生产奠定了坚实的基础.

关键词：蛋白质工程、磷脂酶D、磷脂酰丝氨酸、催化通道、催化距离、定点突变

所属期刊栏目：41

分类号：TS201.3(食品工业)

资助基金：国家轻工技术与工程一流学科自主课题;江苏省科技支撑计划社会发展项目

在线出版日期：2020-09-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：98-103,108