单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光SPIA方法的建立

摘要：

以单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,Lmonocytogenes)hlyA基因为靶序列,设计5'端为RNA序列,3'端为DNA序列的嵌合引物和链终止Blocker序列,经过优化,建立实时荧光单引物等温扩增(Real-timefluorescence SPIA)方法,进行特异性、检出限实验,并对不同DNA提取方法进行比较.结果显示,确定荧光染料SPIA法的最佳反应温度为58℃,反应30 min,引物特异性良好,只有4株不同来源的L.monocytogenes DNA产生典型的S型荧光扩增曲线.对L.monocytogenes纯培养DNA的检出限为3.6×101 fg/μL,相应菌液浓度为1.2×101 CFU/mL;Real-time fluorescence SPIA检测试剂盒法、水煮法、溶菌酶-蛋白酶K法、饱和酚提取法四种方法提取DNA,均产生典型的扩增曲线,Ct值没有明显差异.对人工添加猪肉火腿样品中的L.nonocytogenes,采用水煮法提取DNA的检出限为1.1×102 CFU/g.结果表明,所建立的Lmonocytogenes的Real-time fluorescence SPIA新型等温扩增方法,特异性强、灵敏度高、不受DNA纯度的影响、快速、简便.

关键词：单引物等温扩增、荧光、单核细胞增生李斯特氏菌、hlyA基因

所属期刊栏目：38

分类号：TS201.3(食品工业)

资助基金：质检公益项目201310126

在线出版日期：2017-11-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：275-279,308