Bcl-xl和IGF-1受体特异性siRNA真核表达载体的设计、构建及鉴定

摘要：

目的:构建能表达靶向Bcl-XL mRNA和IGF1 RmRNA的siRNA真核表达质粒.方法:从GeneBank 中搜索Bcl-XL(NM_138578)和IGF-1R (NM_000875)基因组标准序列,根椐siRNA设计原理各基因选取两段19 bp的碱基序列作为靶目标,根据其序列构建siRNA真核表达质粒:psiBcl-XL1和psiBcl-XL2以及psiIGF1R1 和psiIGF1R2.随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列,构建表达siRNA的真核表达质粒作为质粒对照psiHK.所构建的质粒均含有增强绿色荧光基因作为报告基因和SalI的酶切位点.质粒经酶切后,电泳鉴定酶切片段;基因测序分析质粒的碱基序列; 用脂质体转染鼻咽癌CNE2细胞.转染后培养48h,做流式细胞仪检测转染率并采用共聚焦显微镜检测质粒绿色荧光蛋白的表达,通过RT-PCR检测各组质粒对其基因的干扰率.结果:质粒psiBcl-XL1、psiBcl-XL2、psiIGF1 R1 、psiIGF1 R2和psiHK酶切后均可见400bp小带,与预期插入的目的基因大小一致,基因测序证实碱基序列与模板序列相符; 经荧光显微镜下摄片计算转染效率发现:在转染48小时达最高(45%~50%之间);流式细胞仪检测转染后48小时的转染率为48.45%,并在共聚焦显微镜下观察均见大量的细胞表达绿色荧光;psiBcl-XL1、psiIGF-1 R1、psiBclXL2和psiIGF1 R2干扰率分别是:22.1%、50%、70.6%、61.8%.结论:本实验构建了靶向Bcl-XLmRNA和IGF1R mRNA、表达短发夹RNA (short hairpin ribonucleic acid,shRNA)的真核表达质粒.重组质粒能有效转染人鼻咽咽癌细胞,psiBcl-XL2和psiIGF-1 R2与psiBcl-XL1和psiIGF1 R1相比,转染CNE2 48h后其对mRNA的干扰率相对较高.

关键词：鼻咽癌细胞株CNE2、RNA 干扰、Bcl-XL、IGF-1受体

所属期刊栏目：25

分类号：R730.21(肿瘤学)

在线出版日期：2012-05-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：148-153