CRT180基因重组腺病毒载体的构建与鉴定
目的 构建表达CRT180基因重组的腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗奠定实验基础.方法 采用腺病毒表达系统(ViruaPowerTMAdenoviral Expression System)构建重组腺病毒表达载体.首先利用RT-PCR的方法在人肺腺癌细胞系A549细胞中扩增CRT180基因,以连接、转化等方法克隆入载体pENTR/D-ToP0以获得重组的入门克隆,经测序及PCR鉴定正确后,用重组酶(LR ClonaseTMⅡ EnzymeMix)进行入门克隆与腺病毒表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)闻的重组反应,以获得表达克隆(rAd-CRT180)质粒.重组表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacI是使之线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒.用极限稀释法检测病毒滴度用WesternBlot法检测rAd-CRT180载体是否能正确表达CRT180蛋白.结果 用RT-PCR的方法扩增到CRT180基因;重组入门和表达克隆经酶切和PCR鉴定构建正确,重组表达克隆转染HEK293A细胞获得病毒原液并扩增后测定病毒滴度为1.8x1011pfu/mL,且这个病毒能正确表达CRT180蛋白.结论 成功构建了CRT180基因的重组腺病毒戴体,可为此重组载体用于肿瘤基因治疗提供实验依据.
钙网蛋白、重组腺病毒载体、肿瘤基因治疗、克隆、包装细胞、表达载体
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R73-34(肿瘤学)
山东省医药卫生科技发展计划项目2007HWl34;2009HW087;山东省教育厅科研发展计划项目J07YE06;沂市科技发展计划项目090103071
2010-06-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
13-16,29,封4
