异功散调节巨噬细胞铁代谢的机制研究

摘要：

目的:研究异功散调节慢性病贫血(ACD)铁代谢的作用机制.方法:①体外培养小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞,分为空白组和异功散干预组(0.01、0.1、1、1.25、2、2.5、3.75 mg/ml),各组给予相应浓度干预,孵育24 h、48 h和72 h后CCK8检测细胞活性,筛选有效浓度.②取RAW 264.7细胞分为空白组、脂多糖(LPS)组、异功散低剂量(0.1 mg/ml)组、异功散高剂量(1.0 mg/ml)组、LPS+异功散低剂量(0.1 mg/ml)组和LPS+异功散高剂量(1.0 mg/ml)组.预先配置含不同浓度异功散的DMEM培养基,对应加入各药物干预组.预处理1h后再加入0.1 μg/m1 LPS刺激.细胞培养24h、48 h后,比色法检测细胞内外铁含量,PCR检测细胞HAMP和膜铁转运蛋白(FPN)的基因表达水平,Western blot检测细胞信号转导转录激活因子3(STAT3)和磷酸化STAT3(p-STAT3)的蛋白表达水平.③取人肝癌HepG2细胞,在上述分组基础上增加抑制剂+LPS组、LPS+抑制剂+异功散低剂量(0.1 mg/ml)组和LPS+抑制剂+异功散高剂量(1.0 mg/ml)组.预先配置含不同浓度异功散的DMEM培养基,对应加入各药物干预组.预处理1h后,各抑制剂干预组加入STAT3阻断剂(10 μmol)处理10 min,再加入0.1 μg/ml LPS刺激.细胞培养48 h后,PCR检测细胞HAMP基因表达水平.结果:①0.01～3.75 mg/ml异功散干预RAW 264.7细胞48 h内无细胞毒性作用,且能促进细胞增殖.选取0.1 mg/ml和1.0 mg/ml为有效浓度.②无LPS刺激状态下,细胞培养24 h、48 h后,异功散低、高剂量组的细胞外铁含量较空白组显著降低(P＜0.05),但细胞内铁含量无明显变化.LPS刺激状态下,细胞培养24h、48 h后,LPS组细胞外铁含量较空白组显著降低(P＜0.05),而细胞内铁含量明显升高(P＜0.05);与LPS组比较,LPS+异功散低剂量组细胞外铁含量无明显变化,细胞内铁含量降低(P＜0.05),LPS+异功散高剂量组细胞外铁含量升高(P＜0.05),细胞内含量铁降低(P＜0.05).③无LPS刺激状态下,与空白组相比,异功散低、高剂量组细胞培养24h、48 h后HAMP mRNA表达无明显变化,异功散高剂量组细胞培养48 h后FPN mRNA表达量显著升高(P＜0.01),且高剂量组细胞FPN mRNA表达水平较低剂量组显著升高(P＜0.01).LPS刺激状态下,细胞培养24 h、48 h后,与空白组相比,LPS组细胞HAMPmRNA表达显著增多(P＜0.05),FPN mRNA表达明显降低(P＜0.05,P＜0.01);与LPS组相比,LPS+异功散高剂量组细胞HAMP mRNA表达显著降低(P＜0.05),FPN mRNA表达显著升高(P＜0.05,P＜0.01);且LPS+异功散高剂量组细胞FPN mRNA表达水平较LPS+异功散低剂量组显著升高(P＜0.05,P＜0.01).④无LPS刺激状态下,细胞培养24 h、48 h后,与空白组相比,异功散低、高剂量组细胞STAT3和p-STAT3蛋白表达无明显变化.LPS刺激状态下,细胞培养24h、48 h后,与空白组相比,LPS组细胞STAT3蛋白表达无明显变化,p-STAT3蛋白表达有上调趋势;与LPS组相比,LPS+异功散低剂量组和LPS+异功散高剂量组细胞p-STAT3蛋白表达有降低趋势,STAT3蛋白表达无明显变化.⑤LPS刺激状态下,细胞培养48 h后,与LPS组相比,LPS+抑制剂组细胞HAMPmRNA表达显著降低(P＜0.01);与LPS+抑制剂组比较,LPS+抑制剂+异功散高剂量组细胞HAMP mRNA表达显著下调(P＜0.05).结论:异功散可通过降低STAT3磷酸化水平,抑制HAMP mRNA过表达,上调FPN mRNA水平,从而促进巨噬细胞内铁的外流,改善LPS诱导的RAW 264.7细胞铁代谢异常,且异功散与STAT3阻断剂在调控HAMP表达方面具有协同作用.

关键词：异功散、铁代谢、巨噬细胞、HAMP、FPN、STAT3

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资助基金：国家自然科学基金面上项目81774271;上海市科委引导类项目17407931500;上海市自然科学基金项目16ZR1425400;上海市卫计委科研项目20174Y0226;上海市宝山区中西医结合医院国自然培育项目GZRPYJJ-201802

在线出版日期：2019-06-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

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