尿源性干细胞的外泌体修复骨不连的作用研究
目的 评估尿源性干细胞(USC)的外泌体(Exos)能否促进骨不连的愈合,并探讨其作用机制.方法 从人尿液中提取并培养USC,采用超滤法提取USC来源的Exos(USC-Exos)用于研究.应用透射电子显微镜检测USC-Exos的形态和粒径,应用QNano平台检测USC-Exos的大小和密度.体外实验:取新鲜分离的USC-Exos悬液,按照不同密度0、107、108个/mL分别配制新的含有USC-Exos的人脐静脉内皮细胞(H uVECs)完全培养基,对应分组为对照组、USC-Exos 107组、USC-Exos 108组.进行CCK-8细胞增殖实验、Transwell迁移实验、成管实验,验证USC-Exos促进HuVECs增殖、迁移、成管作用.体内实验:构建大鼠股骨骨不连的动物模型,将30只大鼠随机分为空白组(向骨不连周围注射500 μL PBS)、不含USC-Exos的纯光致亚胺交联凝胶(piGEL)组(piGEL组,向骨不连周围注射500 μL piGEL)、含有109/mL USC-Exos的USC-Exos-piGEL组(USC-Exos-piGEL组,向骨不连周围注射500 μL USC-Exos-piGEL复合体),每组10只.分别于术后第4、8周行X线摄片、micro-CT检查和组织学检查,术后第8周对组织切片进行免疫荧光检查,观察愈合情况和骨不连周围血管再生情况.结果 USC-Exos直径约80 nm,形态呈类球形,有完整的膜结构,Exos悬液包含的USC-Exos约为1.97×1010个/mL,直径90～160 nm.CCK-8增殖实验:细胞培养第4、5、6天,USC-Exos 107组和USC-Exos 108组HuVECs的波长450 nm处吸光度(A450)值均显著高于对照组同时间(P值均＜0.05),USC-Exos 108组HuVECs的A450值显著高于USC-Exos 107组同时间(P值均＜0.05).Transwell迁移实验:USC-Exos 107组和USC-Exos 108组完成迁移的细胞数均显著多于对照组(P值均＜0.05),USC-Exos 108组完成迁移的细胞数显著多于USC-Exos 107组(P＜0.05).成管实验:USC-Exos 107组和USC-Exos 108组的分支点均显著多于对照组(P值均＜0.05),小管长度均显著长于对照组(P值均＜0.05);USC-Exos 108组的分支点显著多于USC-Exos 107组(P＜0.05),小管长度显著长于USC-Exos 107组(P＜0.05).影像学检查:USC-Exos-piGEL组在术后4周时,骨不连未修复,有骨痂形成,但仍有骨皮质不连续,骨缺损未完全愈合;第8周时,骨不连得到修复,骨皮质连续.USC-Exos-piGEL组术后第4、8周骨不连处的骨体积分数均显著大于空白组和piGEL组(P值均＜0.05).组织学检查:USC-Exos-piGEL组骨不连断端骨皮质连续,新生的骨组织细胞排列尚不整齐,与正常骨组织间有明显的分界,细胞以骨细胞为主,少见骨髓细胞.免疫荧光检查:USC-Exos-piGEL组的血管内皮细胞较多,分布较密,围成的闭合管样结构完整,表明血管生成量较多.结论 USC-Exos能够促进大鼠股骨骨不连的愈合,其修复作用可能与促进骨不连周围血管再生有关.
外泌体、尿源性干细胞、骨不连、血管再生
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R737.9;R331;R683.2
国家自然科学基金81672163
2019-11-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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